核酸纯化前应了解的常见问题
发布时间:2017-07-27
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1、  在提核酸前,对实验样品你应该知道什么?

样品的核酸含量、酶含量、特殊杂质含量。

绝大情况下,使用新鲜样品可以获得最好的结果,但对一些杂质含量高的样品,-20℃保存一天后抽提,可能会有更好的效果。样品如果因为某些原因必须先行保存,也要先简化一下样品:血液最好只保存有核细胞;将样品分割后保存,避免反复冻融;如果实验室不具备合适的保存条件,可将样品先裂解后再保存。

2、  怎样选择裂解方法?

⑴  含蛋白酶的裂解方法,可以认为是抽提基因组 DNA 的首选。某些样品,如肌肉,即使是 RNA 抽提,也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某个时候使用蛋白酶消化蛋白质) ,原因在于这些样品中的蛋白质,是非常难以去除的。该方法是获得最大得率和最高纯度的基础。

⑵  不使用蛋白酶的去污剂裂解方法,仍然在细胞基因组 DNA 抽提方面有优势,尤其是当得率和纯度要求不是最高,而经济性及操作简单很重要时。

① 高浓度蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法,是抽提 RNA 的首选。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜,进而迅速抑制住细胞内的 RNA 酶,从而确保了 RNA 的完整性。除了极少量不适用该方法的样品 – 主要是植物,其它绝大部分样品的 RNA 的抽提,都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。该方法也可用于基因组 DNA 抽提,非常快速简单,但纯度不是很高。
  ② 含 CTAB 的裂解液,几乎成为富含多糖的样品,如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方法。该方法成功与否与两个因素有关:一是 CTAB 的质量,二是洗涤的彻底程度。CTAB 的质量对裂解效率有很大的影响,而且,似乎还说不清楚原因,因为即使是同一公司生产的纯度一样的 CTAB,批号不同,效果就可能差别很大。洗涤去除 CTAB 要比其它的盐难一些,同时, CTAB 的少量残留也会对酶活性有巨大影响,所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。裂解时的温度,多使用 65℃;但如果发现降解严重或者得率太低,可以试一下 37℃ – 45℃ 这个相对低温的区域。
  ③ SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法,具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的特点。控制好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方法成功的关键。蛋白质的沉淀效率在 4℃会更好一些,所以,加入溶液 III 后在4℃静置一段时间以及采用4℃离心去蛋白质,都可以提高质量。该方法不一定要使用 PC 纯化,但结合 PC 纯化,可以获得纯度很高的质粒。RNA 的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A (100μg/ml) 或者在最后的溶解液中加入 RNase A (25 μg/ml) 来实现。总的感觉是,在溶液 I 中使用 RNase A,RNA 的残留少一些。不过,经典沉淀几乎没有办法彻底去除 RNA 残留。另外,对大质粒 (50 kb 以上),该方法可能会有问题。

3、  不同纯化方法之间有什么不同?

⑴  PC 抽提/醇沉淀方法,是一个永不过时的方法。稳定、可靠、经济、方便。PC 抽提可以彻底去除蛋白质,醇沉淀可以去除盐,对于一般的干净的样品 (杂质为蛋白质),该方法完全可以获得高质量的核酸。PC 抽提的关键是,一要混匀彻底,二要用量足够。彻底混匀,才能确保苯酚与蛋白质的充分接触,使蛋白质完全变性。许多人总是担心混匀的剧烈程度是否会对核酸,尤其是基因组 DNA 造成破坏,实际上大可不必如此小心。剧烈的混匀操作,是会部分打断大分子的基因组 DNA,但该破坏作用不会强烈到 DNA 变成 10kb 以内的小片段。手剧烈晃动混匀后,基因组 DNA 的片段,大部分会大于 20kb,这个大小,除了一些特别的要求外,对 PCR 和酶切,都是完全适用的。如果要求的片段非常大,如构建文库用,则不能使用剧烈的混匀方法,而只能来回温和颠倒混匀──此时的关键是:裂解液的比例要足够大,使体系不要太粘稠。用量要足够,是因为苯酚去除蛋白质是有一定的饱和度的,超过了该饱和度,裂解体系中的蛋白质不会被一次去除,必须靠多次抽提,方可彻底去除。另外,体系太粘稠的坏处是,蛋白质难以彻底去除,以及基因组 DNA 会断裂得更厉害,所以要注意裂解液与样品的比例。PC 抽提的另外一个用途是,利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特点,在 RNA 抽提时获得 DNA 残留极少的 RNA。不过有一点要提醒的是,有些植物样品,在去除某些杂质之前,是不能使用 PC 抽提的,否则核酸必定降解。总之,该方法的最大的问题是不适合大规模抽提。
⑵  高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法,与 PC 抽提方法相比,除了纯度的稳定性可能要低一点外,该方法几乎克服了 PC 抽提的所有缺点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是,可以用于大规模抽提,不足是纯度 (蛋白质残留) 不够稳定。蛋白质的沉淀效率在 4℃会更好一些。
⑶  介质纯化方法,是一个越来越受到重视的方法。其最大特点是非常适合大规模核酸抽提,并且因为受人为操作因素影响小,纯度的稳定性很高 (虽然纯度不一定比PC 纯化方法更高)。其致命弱点是样品过量。介质可以分为两大类,一类是柱式的,即介质被预先装填在下面是通的柱子里;另外一类则是颗粒状 (如Glassmilk、磁性小珠等)。颗粒状的介质的纯化操作与经典的醇沉淀差别不大,都是通过数次的加液-倒液过程,干燥后,溶解即可获得纯化好的核酸。柱式纯化的操作虽然也是有加液-倒液过程,但因为加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中,与含有核酸的柱子完全是分开的,所以洗涤更彻底,操作更省力 (不用操心将核酸倒掉了,或者液体的残留)。不过,介质纯化方法的成本是最高的,而目前核酸纯化试剂盒也多为此方法。

4、 醇的沉淀

⑴  醇的沉淀,目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来,从而实现核酸与其它杂质 – 主要是盐 – 的分离。实际操作中,许多杂质也会与核酸一起被醇沉淀下来,尤其是当其它杂质的浓度也比较高的时候。醇的沉淀并不是非常特异性的,任何有机大分子及一些盐,当浓度达到一定水平后,都可能同步被沉淀下来。如果核酸抽提的起始样品是比较“脏”的,原则上不要使用低温沉淀。低温沉淀能提高沉淀效率:当核酸浓度很低时,效果明显;当核酸浓度比较高时,效果不明显,但却会导致杂质的大大增加。TRIzol 提供的一个沉淀方案:一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇,可以大大降低多糖残留。
⑵  PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀。虽然它们远没有醇沉淀的高使用频率,但却各有特点。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA,CTAB 可以从含多糖的裂解体系中将核酸沉淀下来。PEG 是沉淀病毒颗粒的方便手段。

5、 怎样去洗涤沉淀?

洗涤首先一定要将沉淀悬浮起来;第二就是要有一定的时间,尤其是当核酸沉淀比较大时 (使核酸沉淀最终蓬松);第三是少量多次;第四则是去上清要彻底。教科书中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水纸上片刻”,这一描述本身没有问题,且十分方便,但因为他来自国外,自然就有了“水土不服”的问题。如果离心管是经过硅化的,因为液体几乎不挂壁,所以上清可以去除得非常彻底;好的管子,即使没有经过硅化,残留量也非常少,也没有什么问题;差的管子,液体的挂壁非常可观,其残留量多到会影响后续的实验。唯一不受管子质量影响的操作,就是倒掉液体后再短暂离心,将残液用移液器吸出。一定要牢记的是,残液中都含有上一步操作中的杂质,其残留量与混匀程度、核酸沉淀的大小都有关。挥发时去掉的是乙醇,杂质是不会被挥发去除的。另外,核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也决定了洗涤的强度。沉淀越大,裂解液的裂解能力越强,洗涤越要彻底:放置时间相对要长一点,洗涤次数也要考虑增加。最关键的,洗涤一定要用室温的 75% 乙醇。

6、 怎样保存核酸?

纯化后的核酸,最后多使用水或者低浓度缓冲液溶解;其中 RNA 以水为主,DNA 则多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。经典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解,认为 EDTA 可以减少 DNA 被可能残留下来的 DNase 降解的风险;如果操作过程控制得当,DNase 的残留几乎是可以忽略的,完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。基本上,核酸在保存中的稳定性,与温度成反比,与浓度成正比。如果温度合适,保存中核酸发生降解或者消失,首要原因是酶残留导致的酶解,第二个原因则是保存核酸溶液的 pH 值不合适导致的水解 (RNA 在弱酸性更稳定,而 DNA 在弱碱性更合适)。还有一个不为人重视的,就是 EP 管对核酸的影响。首先一定要坚信一点,那就是核酸一定会与装它的容器的接触面发生反应,达到某种均衡。EP 管的材质,首先可能吸附核酸,其次还可以诱导核酸的结构发生某些变化,如变性。在核酸的浓度比较高时,这个现象可能观察不到;当核酸浓度很低时,则比较明显了。如抽提的质粒电泳的构型越来越多,除了原来的三种带型外,还可能出现 denatured cc 、multimeric forms of cc 等等带型。在低浓度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以稳定核酸,虽然已经为实验所证明,但许多实验人员并没有将该建议当回事。

7、 核酸质量检测

将抽提好的核酸直接用于后续的实验,是唯一可靠的检测方法;除此之外的检测方法,都是相对的,而且并不十分可信。目前用于正式实验前检测核酸质量的方法,一是电泳,二是紫外分光光度仪。电泳检测的主要是核酸的完整性和大小,只要核酸不是太小或者太大 (超出电泳分离范围),该方法还是非常可信的;电泳还可以用于估计核酸的浓度,但其准确度与经验有关;另外,电泳也可能提供某些杂质污染的信息,但是同样与经验有关。紫外分光光度仪检测的是纯度和核酸含量,然而,由于紫外分光光度仪不能确保非常准确,而该仪器的灵敏度又非常高,所以,提供的结果并不十分可信。一般讲,同时进行紫外和电泳检测,综合二者的结果,可以做出一个更合理的判断。但由于这两个方法都有缺陷,所以,即使出现坏的结果能用于后续实验而好的结果却不能用于后续实验,也不用大惊小怪。