PCR常见问题分析之一
发布时间:2017-07-27
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1  PCR产物的电泳检测时间 
  一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失。

 

2  假阴性,不出现扩增条带,应该怎么办? 
  PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及用量, ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

 

3  出现假阳性怎么办? 
  出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。 
  引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。 
  靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及进样枪头等均应一次性使用。必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除。 

4  出现非特异性扩增带怎么办?

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量,适当增加模板量,减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。

 

4.1  怎样检测引物是否合成的好?

可以在DHPLC上看一下,80度全变性的情况下一条带就可以了。如果合成的不好,产物自然不特异了。 

4.2  使用了比较好的Taq酶,且引物没有出现问题,考虑如下几点: 
  1。模板是否过量? 
  2。退火温度是否可降高1-2度? 
  3。Mg的浓度控制在1.5mM?  

5  出现片状拖带或涂抹带怎么办? 
  PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有:减少酶量,或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量,减少循环次数。