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无内毒素质粒DNA大量提取试剂盒(N1051)

价格: 1200.00
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N1051(10次)

无内毒素质粒DNA大量提取试剂盒(硅胶膜离心柱法)

 

产品组分

 

货号

N105110次)

RNase A10 mg/ml

600 μl×2


溶液

100 ml


溶液

100 ml


溶液

120 ml


溶液PB

120 ml


溶液PX

120 ml


溶液W

40 ml


溶液Eluent

20 ml


DNA纯化柱

10


说明书

1



溶液W初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释,即含60%

乙醇。

溶液、溶液、溶液PB中含碱和变性剂,请不要直接

接触皮肤。

上述产品组分均可单独购买,详见产品索引。

产品说明

本产品采用了经典的硅胶膜及碱裂法技术,用于转染级质粒DNA的大量提取。纯化原理是碱裂解细菌后,硅胶膜柱高效可逆地吸附体系中的质粒DNA(高盐、低pH值),蛋白及其它杂质不被吸附而被除去,被吸附的质粒DNA在低盐、高pH值条件下再被洗脱纯化出来。同时,配有高效的内毒素去除液,确保所获质粒DNA中无内毒素污染。一次可从100 ml过夜培养的菌液中纯化得到400-1000 μg高纯度转染级质粒DNAOD260/280=1.7-1.9),此质粒DNA可直接用于用于多数细胞的转染实验。

 

质量控制

从大肠杆菌提取pGEM质粒DNA。提取的质粒DNA质量通过琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切和序列测定分析。

 

保存条件

RNase A:可室温保存1年以上,低温可长期保存。RNase A为浑浊溶液。初次使用本试剂盒时,请将RNase A全部加入到溶液中,均匀混合后于4℃保存。可保存6个月。

其他试剂:室温保存。

若溶液出现沉淀,请于37℃保温溶解。待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

 

注意事项--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

 

溶液Ⅰ在使用前先加入RNase A(将试剂盒中提供的RNase A全部加入),混匀后4℃保存,可保存6个月。

溶液W第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明加入无水乙醇,即40 ml溶液W中加入60 ml无水乙醇,用后立即盖紧盖子。

若溶液Ⅱ出现沉淀,请于37℃保温溶解,待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

注意不要直接接触溶液Ⅱ和溶液Ⅲ,使用后立即盖紧盖子。

提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10 kb 的大质粒,应加大菌体使用量。高拷贝质粒推荐使用量为100ml,得率一般在0.5 mg~1.5 mg 左右;低拷贝质粒推荐使用量为200ml,得率一般在200~400μg 。溶液Eluent 应在65℃水浴预热,在吸附和洗脱时可以适当的延长时间,以增加提取效率。其它步骤相同。

本产品适用于革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌中的质粒DNA提取。由于革兰氏阳性菌外被一层较厚的细胞壁,会严重影响碱裂解细菌细胞的效率。因此,必须在碱裂解细胞前用溶菌酶(N9021)消化细胞壁。处理方法为:离心收集适量菌体,弃上清,加入250 μl溶液Ⅰ,充分振荡悬浮菌体。加入溶菌酶使其终浓度为10-20 mg/ml左右,37℃处理30min。溶菌酶的浓度和处理时间可根据菌株的不同与具体的实验条件加以调整。

所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心,速度为8,000 rpm(约8,228×g)。

请严格遵照操作步骤操作。

操作步骤--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

收集100 ml菌液。8,000 rpm离心5min,弃上清。尽量吸除上清,为确保上清液全部吸取,请倒置在干净的吸水纸上。

   ●  应根据所培养菌体的浓度与拷贝数确定收集的菌液量。如果菌液浓度过低或低拷贝质粒,可收集2100 ml菌液并将菌体沉淀收集到一个离心管中。菌体的体积与质粒拷贝数参见注意事项。

加入7.5 ml溶液Ⅰ/ RNase A混合液,漩涡剧烈振荡直至菌体重新悬浮。室温静置5-10min

   ●  初次使用本试剂盒时,请将RNase A全部加入到溶液中,均匀混合后于 4保存。可保存6个月。

●  不要残留细小菌块。菌体悬浮充分与否将决定质粒DNA得率的高低。

  ●  室温静置1-2 min是为使溶液中的RNA被充分降解。

加入7.5 ml溶液Ⅱ,轻柔地反复颠倒混匀12次。室温放置3-5min,使菌体充分裂解,直至形成澄清的裂解溶液。

   ●  若溶液出现沉淀,请于37保温溶解。待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

    ●  不可剧烈混和,否则会使染色体DNA断裂。

   ●  此步骤不宜超过5 min

加入10 ml溶液Ⅲ。立即轻柔地反复颠倒混匀6-10次,此时会出现白色絮状沉淀。

   ●  加入溶液Ⅲ后,应立即混匀避免产生局部沉淀。

5  8,000 rpm室温离心12min,收集上清。

将上清置于DNA纯化柱中,静置5 min

    ●  如果收集的上清液过多,超过DNA纯化柱容积(15 ml),可将上清分次加入DNA纯化柱中。

7  8,000 rpm 离心2min,弃滤液。

     此时质粒DNA被吸附于DNA纯化柱中的硅胶膜上。

加入10 ml 溶液PB8,000 rpm 离心2 min,弃滤液。

    ●  此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱,以获得高质量质粒DNA

加入10 ml溶液PX8,000 rpm 离心2min,弃滤液。

    ●  此步骤可去除溶液中的内毒素

10  加入10 ml溶液W8,000 rpm 离心2 min,弃滤液。

11  加入10 ml溶液W8,000 rpm 离心2 min,弃滤液。

12  8,000 rpm离心4min,以去除纯化柱中残留的液体。打开纯化柱的管盖,室温放置5min,将纯化柱充分晾干。

     ●  此步骤的作用是去除残余酒精,避免降低质粒的生物学活性,影响下游酶促反应。

13  DNA纯化柱置于新的50 ml离心管中。向纯化柱中央处,悬空滴加1.5-2 ml溶液Eluent65℃预热),室温放置5min

8,000 rpm离心2min。管底即为高纯度质粒DNA。质粒DNA置于-20℃保存。

     ●  溶液Eluent可用无菌双蒸水代替,但其pH需为8.0-8.5,加入体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。对溶液Eluent

      ●  65℃预热,会提高提取质粒的产量。


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