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高纯度质粒小量提取试剂盒(N1011-N1012-N1013)

促销: 210.00~645.00
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N1011(50次) N1012(100次) N1013(200次)

高纯度质粒小量提取试剂盒

 

产品组分

货号

N1011

50次)

N1012

100次)

N1013

200次)

RNase A

150 μl

300 μl

600 μl

溶液

15 ml

30 ml

60 ml

溶液

15 ml

30 ml

60 ml

溶液

20 ml

40 ml

80 ml

溶液PB

30 ml

50 ml

100 ml

溶液W

30 ml

30 ml×2

40 ml×3

溶液Eluent

5 ml

10 ml

20 ml

DNA纯化柱

50

100

200

说明书

1

1

1

 

RNase A的浓度为10 mg/ml

溶液W初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释,即含60%乙醇。

溶液、溶液、溶液PB中含有碱及蛋白变性剂,请不要直

接接触皮肤。

上述产品组分均可单独购买,详见产品索引。

产品说明

本产品采用了经典的硅胶膜及碱裂法技术,可用于质粒DNA的小量纯化。其纯化原理是碱裂解细菌后,硅胶膜柱高效可逆地吸附体系中的质粒DNA(高盐、低pH值),同时去除蛋白及其它杂质,被吸附的DNA在低盐、高pH值条件下再被洗脱纯化出来。一次可从1-5ml过夜培养的菌液中提取10-40 μg高纯度质粒DNAOD260/280 = 1.7-1.9),此质粒DNA可直接用于DNA序列分析以及各种酶促反应等。

 

质量控制

从大肠杆菌提取pGEM质粒DNA。提取的质粒DNA质量通过琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切和序列测定分析。

   

保存条件

本产品除RNase A外,其余组分可室温保存1年以上。RNaseA

为浑浊溶液,室温运输,-20保存。初次使用本试剂盒时,请

RNase A 全部加入到溶液中,均匀混合后于4℃可保存6

个月。

若溶液出现沉淀,请于37℃保温溶解,待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

 

 

注意事项--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

 

溶液在使用前先加入RNase A(将试剂盒中提供的RNase A全部加入),混匀后4℃保存,可保存6个月.

溶液W第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明加入无水乙醇,即30 ml溶液W中加入45 ml无水乙醇,用后立即盖紧盖子。

若溶液出现沉淀,请于37℃保温溶解,待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

注意不要直接接触溶液和溶液,使用后立即盖紧盖子。

提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如为高拷贝质粒,建议使用2 ml菌液,可提取10-15 µg质粒。低拷贝质粒或大于10 kb质粒,建议使用5-10 ml菌液(按照比例增加溶液、溶液、溶液的用量),可提取4-6 µg质粒。溶液Eluent 应在65℃水浴预热,在吸附和洗脱时可以适当的延长时间,以增加提取效率。其它步骤相同。

本产品适用于革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌中的质粒DNA提取。由于革兰氏阳性菌外被一层较厚的细胞壁,会严重影响碱裂解细菌细胞的效率。因此,必须在碱裂解细胞前用溶菌酶(N9021)消化细胞壁。处理方法为:离心收集适量菌体,弃上清,加入250 μl溶液,充分振荡悬浮菌体。加入溶菌酶使其终浓度为10-20 mg/ml左右,37℃处理30min。溶菌酶的浓度和处理时间可根据菌株的不同与具体的实验条件加以调整。

所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心,速度为12,000 rpm

溶液Eluent10 mM Tris-HCl, pH 8.5)中不含EDTA,其收集的DNA片段可直接用于各种酶促反应等,不会影响后续试验。

为了保证回收效率,请不要使用未调整pH值的超纯水洗脱目的片段。

请严格遵照操作步骤操作。

操作步骤--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

1.5 ml离心管收集1-5 ml菌液。12,000 rpm离心1min,弃上清。

●  应根据所培养菌体的浓度与质粒的拷贝数,确定收集的菌液量。菌量过大可能导致溶菌不充分,纯化

时影响质粒纯度。菌体的体积与质粒拷贝数参见注意事项。

加入250 μl溶液Ⅰ/RNase A混合液,涡旋剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。室温静置1-2min

●  初次使用本试剂盒时,请将RNase A全部加入到溶液中,均匀混合后于 4℃保存。可保存6个月。

●  不要残留细小菌块。菌体悬浮充分与否将决定质粒DNA得率的高低。

●  室温静置1-2 min是为使溶液中的RNA被充分降解。

3  加入250 μl溶液,轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2 min,使菌体充分裂解,直至形成澄清的裂解溶液。

●  若溶液出现沉淀,请于37℃保温溶解。待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

●  不可剧烈混合,否则会使染色体DNA断裂,造成基因组污染。

●  此步骤不宜超过5 min

加入350 μl溶液,立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此时会出现白色絮状沉淀。

5  12,000 rpm室温离心10 min,收集上清。

将上清置于DNA纯化柱中,静置1-2 min

●  如果收集的上清液过多,超过DNA纯化柱容积(700 μl),可将上清分次加入DNA纯化柱中。

7  12,000 rpm离心1 min,弃滤液。

 此时质粒DNA被吸附于DNA纯化柱的硅胶膜上。

加入500 μl 溶液PB12,000 rpm离心1 min,弃滤液。

●  此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱,以获得高质量质粒DNA

加入500 μl溶液W12,000 rpm离心1 min,弃滤液。

●  溶液W初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释,即含60%乙醇。

10  加入500 μl溶液W12,000 rpm离心1 min,弃滤液。

11  12,000 rpm离心3min,以彻底去除纯化柱中残留的液体。

12  DNA纯化柱置于新的离心管中。向纯化柱中央处,悬空滴加50-100 μl溶液Eluent,室温放置2 min12,000 rpm离心1 min,管底即为高纯度质粒DNA。质粒DNA-20℃保存。

●  溶液Eluent可用无菌双蒸水代替,但其pH需为8.0-8.5溶液Eluent的加入体积视质粒拷贝数多

少、用户对质粒浓度要求而定。对溶液Eluent 65℃预热,会提高提取质粒的产量。



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