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M-MLV(重组型逆转录酶)(R1041-R1042)

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R1041( 25次) R1042( 50次)

M-MLV 逆转录酶

产品说明

M-MLV逆转录酶是由一个 71 kD的单亚基组成的重组型DNA逆转录聚合酶。可以催化以RNADNARNA杂交链为模板的互补DNA 的聚合反应。本酶经修饰RNase H活性比普通的逆转录酶要弱很多,因此在合成第一链cDNA的过程中,可保证RNA的降解程度较低,从而使得率提高。

 

产品组分

组分

R1041

R1042

M-MLV (200U/μl)

5000U/25 μl

10000U/50 μl

first-strand buffer

100 μl

200 μl

R1041可进行25次逆转录反应,R1042可进行50次逆转录反应(20 μl 标准 PCR 反应体系,每次使用 M-MLV 1 μl)。

M-MLV 储存液成分

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)200 mM NaCl0.1 mM EDTA1 mM DTT0.01% NP-4050% glycerol

5x first-strand buffer 成分

250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)375 mM KCl15 mM MgCl250 mM DTT

 

保存条件

-20℃保存,避免反复冻融。

 

质量检测

逆转录酶活性检测

使用[32P]dCTP作为标记,200 UM-MLV1μg1.2 kbRNA为模板进行逆转录反应,最低可得到120 ngcDNA,所得cDNA长度 > 全长的90%

核酸外切酶活性检测

混合50 ng的标记DNARNA200 U M-MLV反应缓冲液体系中,37℃温浴1 h,检测DNARNA降解都不到总量的1%

核酸内切酶活性检测

混合1μgⅠ型超螺旋质粒DNA500 U M-MLV反应缓冲液体系中,37℃温浴1 h,琼脂糖电泳检测,无明显的剪切。

 

适用范围

第一链cDNA 合成;cDNA 文库构建;RT-PCR;引物延伸;3' 5' RACE

 

注意事项

l  成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长的完整性并且不含逆转录酶的抑制剂,如EDTA SDS。用于cDNA合成反应的溶液试剂尽可能用DEPC进行处理,并在高压灭菌后使用。有些试剂不能用高压灭菌处理时,首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后,再将溶液进行过滤除菌处理。

l  为了增加贮存RNA样品的稳定性,可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中,存于-70℃。用于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时,可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaCl0.2 M同时加入4倍体积的乙醇,室温放置3-5 min10,000 rpm离心5 min

l  在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂(RNasin)以增加cDNA合成的长度和产量。在第一链合成反应中,RNase抑制剂在缓冲液和还原剂(如 DTT)存在的条件下加入,因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性,从而释放出RNase。但是RNase抑制剂仅防止RNase ABC RNA的降解,并不能防止皮肤上的RNase,因此尽管使用了RNase抑制剂,也要小心不要从手指上引入RNase

l  较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开,增加反应的产量。

l  使用简单的RNA纯化方法即可获得满足RT-PCR反应的RNA,但为了保证实验的成功率,建议使用GTC法(异硫氰酸胍法)制备的高纯度RNA

l  为防止RNA降解,应尽量避免反复冻融,最好保存于-70℃

l  最佳的PCR反应条件,因PCR扩增仪的不同而不同,所以在使用您的样品之前最好先试做一下control反应,以确定最佳的PCR反应条件。

l  cDNA产物应置于-20℃保存。

l  当以cDNA为模板进行PCR之前,使用RNase H处理cDNA,可以提高PCR反应的灵敏度。

 

操作步骤

1 在冰浴的无菌离心管中配制下列混合物

 RNA

1-5 μg

Oligo (dT)15 Random primer

1 μl

RNase-free ddH2O

To 13.4 μl


2
进行变性退火反应

70℃温浴5 min,简短离心后冰浴5 min

3 在上述离心管中配制反转录反应液

 上述反应液

13.4 μl

5× first-strand buffer

4 μl

dNTPs10 mM

1 μl

RNasin

0.6 μl

M-MLV

1 μl

Total

20 μl


4
按下列条件进行反转录反应

Oligo (dT)15 42℃温浴60 min

Random primer 37℃温浴60 min

5 终止反应

70℃温浴5 min终止反应,置冰上进行后续实验或-20℃保存。

6 RNase-free ddH2O将反应体系稀释到50μl,取2-5μl进行PCR扩增反应。

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